Eozinofillerin fonksiyonlarında NLRC4 inflamazom kompleksinin rollerinin incelenmesi


Creative Commons License

Akkaya I., öZEL İ., Bilgiç Ş. N. , Çıracı C.

İmmunolojide moleküller sempozyumu, İzmir, Türkiye, 18 - 21 Ekim 2018, ss.17

  • Yayın Türü: Bildiri / Tam Metin Bildiri
  • Basıldığı Şehir: İzmir
  • Basıldığı Ülke: Türkiye
  • Sayfa Sayıları: ss.17

Özet

AMAÇ: Doğal bağışıklığın mokeküllerinden NOD benzeri reseptörlerin (NLR), hasar ve patojen kaynaklı moleküler motifleri tanıma yoluyla aktifleşerek inflamazom komplekslerini oluşturduğu ve pro-formdan aktif formlarına kesilen IL-1B ve IL-18 sitokinlerinin hücre dışına salgılanmasına neden olduğu bilinmektedir. Bu sitokinlerin edinsel bağışıklığın, özellikle sırasıyla yardımcı T17 ve T1 hücre cevabının koordinasyonunda rol oynadığı sayısız çalışmada rapor edilmiştir. Bu çalışmanın amacı; insanda 22 üyeden oluşan, NLR ailesinin üyesi olan ve inflamazom adı verilen protein kompleksleri oluşturduğu bilinen NLRC4’ün, bağışıklık yanıtının oluşumunda sahip olduğu işlevi anlamaktır. Bunun için daha önce NLR bakımından henüz çalışılmamış olan eozinofilleri seçtik. Eozinofillerin periferik kandaki bağışıklık sistemi hücrelerinin %1’inden azını oluşturmaları nedeniyle, EoL-1 hücre hattını kullandık.
YÖNTEM: EoL-1 hücreleri; IL-5, IL-13, PAM3CSK4 (PAM) ve flagella ile uyarıldı. NLRC4 ve Siglec-8 mRNA seviyeleri kantitatif RTqPCR; NLRC4, ASC ve aktif kaspaz-1 protein seviyeleri ise western blotlamayla belirlendi. IL-1B ve IL-6 salgılanması ELISA
tekniğiyle analiz edildi. Siglec-8  ifade eden hücreler Akan Hücre Ölçer ile analiz edildi.
BULGULAR: (1) IL-5 ve IL-13 sitokinleriyle uyarılan EoL-1 hücrelerinde bulunan NLRC4’ün mRNA ve protein ekspresyonunun kontrole göre anlamlı bir şekilde arttığı gözlendi. (2) PAM ve flagella ile birlikte uyarılan hücrelerde benzer bir artış gözlenirken
inflamazom üzerinden aktifleşen IL-1B’de yaşanan anlamlı artış inflamazomdan bağımsız üretilen IL6’da tespit edilmedi. (3) PAM flagella verilen hücrelerde, aktif kaspaz-1 protein seviyelerinde artış yaşansa da ASC adaptör proteininde bir değişim gözlenmedi.
(4) PAM-flagella verilen hücrelerde, apoptoz aktivasyonuna yol açan Siglec-8’in mRNA ekspresyonunda artış yaşandığı görülürken, Siglec-8 ve alerjik reaksiyonlarda önemli rollere sahip olan FcεRI-α ekspresyonunda, kontrol ve PAM verilen örneklere göre anlamlı bir artış gözlendi.
SONUÇ: Bulgularımız, NLRC4 inflamazomunun eozinofillerde ASC’ı dahil etmeden kompleks oluşturabileceğini ve NLRC4’ün eozinofil fonkiyonlarında önemli rollerinin olabileceğini ortaya koymuştur. Kronik eozinofilik pnömoni, eozinofilik özefajit, eozinofilik
granülomatozis, alerji, parazitik enfeksiyonlar, astım gibi eozinofilik hastalıkların tanı ve tedavisinde, yeni hedef moleküllerin bulunması daha etkin ilaç tasarımlarına yardımcı olacaktır.

AIM: NOD-like Receptors are known to induce an innate response upon recognition of Danger (DAMP) and Pathogen Associated Molecular Patterns (PAMP). This immune response can be due to inflammasome complex formation, resulting in the secretion of IL1B and IL18. These cytokines have been reported to have roles in coordinating Th1 and Th17 responses. This study focuses on one of the members of NLR gene family, called NLRC4. Based on in vivo preliminary results, we conducted a series of in vitro experiments using, EoL-1 cell line as a model of human eosinophils.

Method: EoL-1 cells were induced with IL-5, IL-13, PAM3CSK4 (PAM) and flagella (FLA) ,respectively and NLRC4 and Siglec 8 expression levels were measured by QPCR at the RNA level and NLRC4 and ASC protein levels by western blotting. Morever, IL1B and IL6 levels were measured by ELISA. Eosinophils specific markers were determined by flow cytometer.

Results: NLRC4 levels were increased both at the RNA and protein level, while ASC adopter molecule was not differentially expressed in EoL-1 cells at the protein level. IL1B was detected to be increased after stimulation with PAM and FLA whereas we did not detect any change in the secretion of IL6, a cytokine included in the experiment as a control. Eosinophilic markers were found to be expressed by the EoL-1 cells to lesser extent than expected but still remained as an ideal model for further experiments.